Javascript ist derzeit in Ihrem Browser deaktiviert.Mehrere Funktionen dieser Website funktionieren nicht, wenn Javascript deaktiviert ist.freier Zugang zu wissenschaftlicher und medizinischer ForschungPeer-reviewte wissenschaftliche und medizinische Open-Access-Zeitschriften.Dove Medical Press ist Mitglied des OAI.Massennachdrucke für die pharmazeutische Industrie.Wir bieten unseren Autoren echte Vorteile, einschließlich einer beschleunigten Bearbeitung von Papieren.Registrieren Sie Ihre spezifischen Daten und spezifischen Arzneimittel von Interesse und wir gleichen die von Ihnen bereitgestellten Informationen mit Artikeln aus unserer umfangreichen Datenbank ab und senden Ihnen umgehend PDF-Kopien per E-Mail zu.Zurück zu Zeitschriften » Zeitschrift für Entzündungsforschung » Band 13YAP-Mangel dämpft Lungenverletzungen nach mechanischer Beatmung durch die Regulierung der M1/M2-MakrophagenpolarisationAutoren Luo Q, Luo J, Wang YVeröffentlicht am 31. Dezember 2020 Band 2020:13 Seiten 1279–1290DOI https://doi.org/10.2147/JIR.S288244Begutachtung durch einmaliges anonymes Peer-ReviewHerausgeber, der die Veröffentlichung genehmigt hat: Professor Ning QuanQiong Luo, Jing Luo, Yanlin Wang Department of Anesthesiology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan, Hubei 430071, Volksrepublik China Korrespondenz: Yanlin Wang Department of Anesthesiology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan, Hubei 430071, Volksrepublik China E-Mail [email protected] Hintergrund: Es gibt Hinweise darauf, dass das Gleichgewicht zwischen Makrophagen-M1- und -M2-Polarisation für die Regulierung der Lungenentzündung während der mechanischen Beatmung (MV) wesentlich ist.Yes-assoziiertes Protein (YAP) ist eine Schlüsselkomponente des Hippo-Signalwegs und soll die Makrophagenpolarisation regulieren.Diese Studie wurde entwickelt, um zu untersuchen, ob YAP während MV zur Lungenentzündung beiträgt.Methoden: Wildtyp- und Makrophagen-YAP-Knockout-Mäuse wurden 12 Stunden lang mechanisch beatmet, um Lungenverletzungen hervorzurufen.Am Ende der MV wurden die Tiere zum Sammeln von Lungengewebe und zur Isolierung von Makrophagen getötet.Darüber hinaus wurde die Induktion der Makrophagenpolarisation in isolierten Makrophagen mit oder ohne YAP-Überexpression in vitro durchgeführt.Lungenverletzungen, YAP-Expression, Makrophagenpolarisation und Zytokine wurden gemessen.Ergebnisse: Hier zeigen wir, dass MV Lungenverletzungen zusammen mit Lungenentzündungen sowie hochregulierte YAP-Expressionen in Lungenmakrophagen induziert.Darüber hinaus weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass ein YAP-Mangel in Makrophagen die Lungenschädigung abschwächt, begleitet von einer verminderten Produktion entzündungsfördernder Zytokine, einschließlich IL (Interleukin)-1β, IL-6 und Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-α).Darüber hinaus weisen sowohl In-vivo- als auch In-vitro-Studien darauf hin, dass YAP-Mangel die M2-Polarisation verstärkt, während die M1-Polarisation gehemmt wird.Im Gegensatz dazu hemmt die YAP-Überexpression die Induktion der M2-Polarisation, verbessert aber die M1-Polarisation.Schlussfolgerung: Unsere Ergebnisse berichten zum ersten Mal, dass die Induktion von YAP in Makrophagen durch die Regulation der M1/M2-Polarisation zur Lungenentzündung während der MV beiträgt.Schlüsselwörter: ja-assoziiertes Protein, Makrophagenpolarisation, Lungenentzündung, mechanische BeatmungMechanische Beatmung (MV) ist eine der am häufigsten verwendeten lebenserhaltenden Techniken in der klinischen Praxis.1 Eine verlängerte MV kann jedoch eine Lungenentzündung verschlimmern, was bei kritisch kranken Patienten zu zusätzlicher Morbidität/Mortalität führen könnte.2,3 Frühere Ergebnisse deuteten darauf hin, dass Makrophagen Polarisierung spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Lungenentzündung nach MV.4,5 Makrophagen können sich in verschiedenen Mikroumgebungen in zwei funktionelle Phänotypen polarisieren: klassisch aktivierte entzündliche (M1) oder alternativ (M2) aktivierte Makrophagen.6 Als Reaktion auf einen Stimulus M2-Makrophagen können entzündungshemmende Zytokine exprimieren, während M1-Makrophagen entzündungsfördernde Zytokine sezernieren.7 Dann kann das Ungleichgewicht zwischen der M1/M2-Makrophagenpolarisation zu einer übermäßigen Produktion entzündungsfördernder Zytokine führen und dient als wichtiger Mechanismus der Entzündungsreaktion.8 Bis heute der zugrunde liegende Mechanismus, durch den MV das Ungleichgewicht der M1/M2-Makrophagenpolarisation in der Lunge induziertGewebe ist noch nicht vollständig verstanden.Das Yes-assoziierte Protein (YAP) ist ein Schlüsselmediator des Hippo-Signalwegs und spielt eine wichtige Rolle bei der Förderung der Krebsentstehung und Arzneimittelresistenz.9 Kürzlich wurde gezeigt, dass YAP an der Entwicklung von Entzündungskrankheiten beteiligt ist;Die Ergebnisse sind jedoch umstritten.Yang und Kollegen berichteten, dass YAP Gefäßentzündungen unterdrückt, indem es die Aktivierung der NF-κB-Signalisierung verhindert.10 Im Gegensatz dazu zeigten Zhou und andere, dass YAP entzündliche Darmerkrankungen verschlimmert, indem es die M1/M2-Makrophagenpolarisation reguliert.11 Alles in allem zeigten diese Ergebnisse eine enge Assoziation zwischen YAP-Expression/-Aktivierung und der Pathogenese von Entzündungen.Es wurde berichtet, dass der Bindegewebewachstumsfaktor (CTGF), ein nachgeschaltetes Gen von YAP, an entzündlichen Erkrankungen beteiligt ist12 und bei akuter Lungenverletzung (ALI) hochreguliert wird.13 Xie und Kollegen zeigten eine signifikante Korrelation zwischen mechanischer Kraft und CTGF bei ARDS-Patienten , und seine Höhe wurde mit dem Überlebensergebnis in Beziehung gesetzt.14 Diese Studie ist von besonderer Bedeutung für die frühzeitige Prävention von Lungenschäden bei Patienten, die MV erhalten.Es ist jedoch unklar, ob YAP am MV-induzierten Ungleichgewicht zwischen pulmonaler M1- und M2-Makrophagenpolarisation und nachfolgender Entzündung beteiligt ist.In der vorliegenden Studie wollen wir die Rolle von YAP bei der Entwicklung einer Lungenentzündung nach MV und den zugrunde liegenden molekularen Mechanismus bestimmen.Wie zuvor berichtet, wurden 11 YAP fl/fl-Mäuse mit zwei loxP-Stellen, die die ersten beiden Exons des YAP-Gens flankieren, mit Lysm-Cre-Mäusen gekreuzt, um YAP in Makrophagen spezifisch auszuschalten (bezeichnet als YAPΔM/ΔM-Mäuse).In dieser Studie verwendeten wir auch YAPfl/fl Lysmcre/wt als YAPΔM/ΔM und YAPfl/fl Lysmwt/wt als Kontrollmäuse (als YAP+/+ bezeichnet).YAP+/+- und YAPΔM/ΔM-Mäuse befinden sich in einem C57BL/6-Hintergrund, die von Cyagen (Suzhou, China) bezogen wurden.Die Tiere wurden unter Standardbedingungen in Einzelkäfigen gehalten.Alle Tierversuche wurden vom Animal Biosafety Level 3 Laboratory der Wuhan University (Nr. ZN2019011) genehmigt und gemäß den Laborrichtlinien für die Verwendung und Pflege von Tieren durchgeführt.15Mäuse wurden mit einer intraperitonealen Injektion von Natriumpentobarbital (50 mg/kg) (China Pharmaceutical Group, Shanghai, China) anästhesiert.Nach 15 Minuten Stabilisierung wurden die Tiere dann tracheotomiert und an ein Kleintierbeatmungsgerät (Harvard Apparatus, MA, USA) angeschlossen. Beatmungsinduzierte Lungenschädigung wurde mit den folgenden Parametern erreicht: Beatmungszeit: 12 Stunden, Atemfrequenz: 65 Atemzüge/min , Tidalvolumen: 20 ml/kg und positiver endexspiratorischer Druck (PEEP): 0 cm H2O.Die bronchoalveoläre Lavage-Flüssigkeit (BALF) wurde aus drei bronchoalveolären Lavagen im oberen Teil der Luftröhre unter Verwendung von 3 ml PBS gewonnen.Die Mäuse wurden am Ende des Experiments durch Blutstropfen getötet.Am Ende des Experiments wurden die Mäuse getötet und die Lungen wurden mit kaltem PBS perfundiert und gesammelt.Dann wurden Leukozyten durch enzymatischen Verdau wie zuvor beschrieben aus der Lunge isoliert.16 Nach 90-minütiger Adhärenzselektion verdauter Gewebeproben wurden nicht anhaftende Zellen weggespült und die Makrophagen in Trizol-Reagenz gesammelt.Außerdem wurden aus dem Knochenmark stammende Makrophagen (BMM) gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll isoliert.17 Kurz gesagt, die Knochenmarksuspension wurde bei 650 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.Dann wurde das Zellpellet in 5 ml Lysepuffer (8,3 % NH 4 Cl, 0,1 M Tris) für 5 min resuspendiert, um die roten Blutkörperchen zu lysieren.Die Zellsuspension wurde erneut bei 650 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.Das Zellpellet wurde gesammelt und in 5 ml RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10 ng/ml rekombinantem Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (M-CSF), resuspendiert.Die Zellen wurden dann 1 Woche lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, um sicherzustellen, dass sich die Knochenmarkszellen vollständig zu BMM differenziert haben.Dann wurde BMM unter Verwendung von kaltem sterilem PBS aus den Differenzierungsschalen entfernt und in RPMI 1640 kultiviert. Die Zellen wurden dreimal mit Puffer (PBS mit 0,5 % Rinderserumalbumin und 0,02 % Natriumazid) gewaschen und mit saurer Phosphatase gefärbt.Die Zellen wurden gezählt, um sicherzustellen, dass der Anteil an positiv gefärbten Zellen, die in weiteren Experimenten verwendet werden, höher als 90 % ist.Isolierte Lungenmakrophagenzellen wurden in MACS-Puffer (BD Biosciences, CA, USA) resuspendiert und mit PE-konjugiertem Anti-Maus-CD11c (ab254183, Abcam), PE-konjugiertem Anti-Maus-F4/80 (ab6640, Abcam), und Alexa Fluor 647-konjugiertes CD206 (MCA2235A647, AbD Serotec), für 30 min bei 4°C.Die Zellen wurden dann gewaschen und mit sekundären Antikörpern für 30 min inkubiert und dann in FACS-Puffer (BD Biosciences) resuspendiert.Die Analyse wurde mit einem BD FACSCalibur-Durchflusszytometer (BD Biosciences) mit FlowJo-Software (Tree Star, OR, USA) durchgeführt.M1- und M2-Makrophagen wurden als F4/80+/CD11c+/CD206– bzw. F4/80+/CD11c–/CD206+ identifiziert.Das Kulturmedium auf BMM wurde durch frisches Medium ersetzt, das 25 mg/ml IL4 und IL-13 oder LPS (15 ng/ml) und IFN-γ (50 ng/ml) für die M2- bzw. M1-Makrophagenpolarisation enthielt.Die Zellen wurden dann für 24 Stunden kultiviert.Zum Zeitpunkt der Ernte wurden Zellen zum Nachweis von M1/M2-bezogenen Genexpressionen durch RT-PCR gesammelt.Die RAW264.7-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten und in DMEM (Life Technologies) kultiviert, das 10 % (v/v) FBS enthielt.Die Überexpression von YAP wurde mit den RAW264.7-Zellen durchgeführt.Die Zellen wurden in Platten mit sechs Vertiefungen ausgesät und 2 &mgr;g YAP-Plasmid oder pcDNA (Vektor) pro Vertiefung wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers (Targeting Systems, CA, USA) transfiziert.Am Tag vor der Transfektion wurden die Zellen auf eine Platte mit 24 Vertiefungen ausplattiert, 10 5 Zellen pro Vertiefung.Die Zellen wurden entweder mit YAP-Plasmid oder -Vektor transfiziert.Nach 48 h wurden die Zellen geerntet und zur weiteren Analyse mit frischem PBS gewaschen.Gesamt-RNA wurde unter Verwendung eines Qiagen RNeasy fibrous Mini-Kits unter Verwendung des vom Hersteller bereitgestellten Protokolls hergestellt, und cDNA wurde unter Verwendung von Prime Script RT-PCR-Systemen (Takara, Otsu, Japan) hergestellt.Quantitative Echtzeit-PCR wurde auf einem CFX-96-Echtzeit-PCR-Nachweissystem (Bio-Rad) durchgeführt.Die in dieser Studie verwendeten Primersequenzen sind wie folgt aufgelistet: IL-1β: Vorwärtsprimer: CTGGTACATCAGCACCTCAC, Rückwärtsprimer: AGAAACAGTCCAGCCCATAC;IL-6: Vorwärtsprimer: TGTATGAACAACGATGATGCACTT, Rückwärtsprimer: ACTCTGGCTTTGTCTTTCTTGTTATCT;IL-10: Vorwärtsprimer: CAGGGATCTTAGCTAACGGAAA, Rückwärtsprimer: GCTCAGTGAATAAATAGAATGGGAAC;Fizz1: Vorwärtsprimer: CCAATCCAGCTAACTATCCCTCC, Rückwärtsprimer: ACCCAGTAGCAGTCATCCCA;Arg1: Vorwärtsprimer: CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG, Rückwärtsprimer: GGAGCTGTCATTAGGGACATCA;Ym1: Vorwärts-Primer: CAGGTCTGGCAATTCTTCTGAA, Rückwärts-Primer: GTCTTGCTCATGTGTGTAAGTGA;TNF-α: Vorwärtsprimer: AGTGACAAGCCTGTAGCCC, Rückwärtsprimer: GAGGTTGACTTTCTCCTGGTAT;iNOS: Vorwärtsprimer: GGAGTGACGGCAAACATGACT, Rückwärtsprimer: TCGATGCACAACTGGGTGAAC;CTGF: Vorwärtsprimer: GTGGAATATTGCCGGTGCA, Rückwärtsprimer: CCATTGAAGCATCTTGGTCG.Western Blotting wurde in einem Standardverfahren durchgeführt.Gewebe- oder Zelllysate wurden in RIPA-Puffer hergestellt, der einen vollständigen Protease-Inhibitor-Cocktail und Inhibitor für Phosphatase enthielt.Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung eines BCA-Proteinassaykits (Abcam, Shanghai, China) bestimmt.Proteine ​​wurden dann durch ein SDS-PAGE-System getrennt.Die Membranen wurden mit primären Antikörpern inkubiert, darunter Anti-YAP (Cell Signaling, MA, USA)), Anti-CTGF (Abcam, Shanghai, China), Anti-Arg1 (Abcam, Shanghai, China) und Anti-iNOS (Abcam, Shanghai, China). China) bei 4°C über Nacht und wurden mit HRP-markiertem Sekundärantikörper sondiert.Die Membranen wurden unter Verwendung eines verbesserten Chemilumineszenzsystems (Kodak, Rochester, USA) sichtbar gemacht.β-Aktin wurde als Ladekontrolle verwendet.Das Expressionsprofil von Zytokinen wurde mit kommerziellen Zytokin-Nachweiskits (R&D Systems, Minneapolis, MN) analysiert.Blockierung, Hybridisierung, Waschbedingungen und Nachweisschritte wurden gemäß den Richtlinien des Herstellers durchgeführt.Lungengewebe wurden mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet.Dann wurden die Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) nach Standardverfahren gefärbt.Lungenverletzungen wurden basierend auf dem Grad des Ödems, der Blutung, der Infiltration von Entzündungszellen und den histologischen Veränderungen, wie zuvor beschrieben, von 0 bis 4 bewertet.18 0: keine Verletzung;1: leichte Verletzung;2: Zwischenverletzung;3: weit verbreitete Verletzung;und 4: schwere Verletzung.Diese Analysen wurden von zwei Untersuchern verblindet durchgeführt.Für jedes Tier wurde der Mittellappen der linken Lunge am Ende des Experiments zur Bewertung des Nass/Trocken-Verhältnisses entfernt.Im Detail wurde zunächst Lungengewebe gewogen, um das Nassgewicht (ww) zu bestimmen.Dann wurden die Gewebe 2 Tage lang bei 80°C getrocknet, um das Trockengewicht (dw) zu erhalten.Schließlich wurde das Nass/Trocken-Verhältnis als (ww-dw)/dw berechnet.Die Zellen wurden mit 3,4 % Paraformaldehyd (PFA) (Maokang, Shanghai, China) für 20 min fixiert und dann mit 0,5 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich) permeabilisiert.Nach 30-minütigem Blockieren in 3 % PBS-BSA wurden die Objektträger mit Anti-YAP (1:200, Abcam, CA, USA) inkubiert.Nach dem Waschen mit PBS wurden die Objektträger mit Ziegen-Anti-Maus-FITC-konjugierten sekundären Antikörpern für 1 Stunde bei 37°C inkubiert.Die Kerne wurden mit DAPI gefärbt.Die Zielproteine ​​wurden mit konfokaler Mikroskopie (ZEISS LSM700) und einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop-Bildsystem nachgewiesen.Außerdem wurde die Immunfluoreszenzfärbung von Lungengewebe wie zuvor beschrieben durchgeführt.19Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt.Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden unter Verwendung des t-Tests durchgeführt.Unterschiede zwischen mehr als zwei Gruppen wurden unter Verwendung von Einweg-ANOVA, gefolgt von einem Post-Hoc-Test von Bonferroni, analysiert.Ein zweiseitiger P-Wert von weniger als 0,05 wurde als signifikant unterschiedlich angesehen.In der vorliegenden Studie führte eine 12-stündige mechanische Beatmung mit einem sehr hohen Tidalvolumen (20 ml/kg) zu offensichtlichen Lungenverletzungen, die sich in Ödemen, Blutungen und Infiltration von Entzündungszellen widerspiegelten (Abbildung 1A).Darüber hinaus waren die histologischen Werte und das pulmonale Nass/Trocken-Verhältnis in der MV-Gruppe im Vergleich zu denen der Kontrollgruppe signifikant erhöht (jeweils p < 0,001) (Abbildung 1B und C).Um die Entzündungsreaktion im Lungengewebe nach MV zu bewerten, wurde die Expression entzündungsfördernder Zytokine einschließlich TNF-α, IL-1β und IL-6 gemessen.Wie in Abbildung 1D–F zu sehen, wurden nach 12 Stunden MV übermäßige Expressionen von TNF-α, IL-1β und IL-6 in verletzten Lungen dokumentiert.Darüber hinaus deuteten RT-PCR- und Western-Blot-Assays darauf hin, dass YAP-mRNA- und -Proteinexpressionen in verletzten Lungen nach längerer MV signifikant hochreguliert waren (Abbildung 1G und H).Der Bindegewebe-Wachstumsfaktor (CTGF), ein nachgeschaltetes Gen von YAP, war im Lungengewebe von Tieren nach MV sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene im Vergleich zu dem der Kontrollen ebenfalls signifikant erhöht (jeweils p < 0,05).Zusammen zeigten diese Ergebnisse, dass eine verlängerte MV eine Lungenschädigung mit übermäßiger Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen sowie einer hochregulierten YAP-Expression induziert.Abbildung 1 Mechanische Beatmung induziert Lungenschäden zusammen mit Entzündungen sowie YAP-Expression.Die histologische Analyse (A) zeigt, dass die mechanische Beatmung (MV) deutliche Lungenverletzungen hervorruft, was sich in erhöhten histologischen Werten (B) und dem Nass/Trocken-Verhältnis (C) widerspiegelt.ELISA-Assays zeigen, dass MV auch eine übermäßige Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen einschließlich TNF-α (D), IL-1β (E) und IL-6 (F) induziert.Darüber hinaus induziert MV die Expression von YAP und seinem nachgeschalteten Gen CTGF in Lungengeweben (G und H).***p < 0,001 vs. Kontrollgruppe.Abbildung 1 Mechanische Beatmung induziert Lungenschäden zusammen mit Entzündungen sowie YAP-Expression.Die histologische Analyse (A) zeigt, dass die mechanische Beatmung (MV) deutliche Lungenverletzungen hervorruft, was sich in erhöhten histologischen Werten (B) und dem Nass/Trocken-Verhältnis (C) widerspiegelt.ELISA-Assays zeigen, dass MV auch eine übermäßige Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen einschließlich TNF-α (D), IL-1β (E) und IL-6 (F) induziert.Darüber hinaus induziert MV die Expression von YAP und seinem nachgeschalteten Gen CTGF in Lungengeweben (G und H).***p < 0,001 vs. Kontrollgruppe.In Anbetracht der bedeutenden Rolle von Makrophagen bei Lungenentzündungen nach MV untersuchten wir die Funktion von YAP in Makrophagen in Bezug auf Lungenentzündungen.Wie in Fig. 2A zu sehen ist, führte ein YAP-Mangel in Makrophagen (YAPΔM/ΔM) zu einer Verringerung von Ödemen, Blutungen und entzündlicher Zellinfiltration.Außerdem waren die histologischen Scores in den YAPΔM/ΔM-Mäusen signifikant niedriger als die der Wildtyp-Mäuse (p < 0,001).Diese Ergebnisse zeigen, dass ein YAP-Mangel in Makrophagen Mäuse vor einer Lungenschädigung nach MV schützt.Die Knockout-Effizienz von YAP in Makrophagen wurde durch Immunfluoreszenzfärbung, RT-PCR und Western-Blots bestimmt (Abbildung 2B–E).Darüber hinaus zeigten ELISA-Assays, dass die Produktion entzündungsfördernder Zytokine, einschließlich TNF-α, IL-1β und IL-6, bei YAPΔM/ΔM-Mäusen signifikant niedriger war als die von Wildtyp-Mäusen (YAP+/+) (p < 0,001 ) (Abbildung 2F–H).Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass ein YAP-Mangel in Lungenmakrophagen Mäuse vor beatmungsinduzierten Lungenschäden mit herunterregulierter Produktion entzündungsfördernder Zytokine schützt.Abbildung 2 YAP-Mangel schützt Mäuse vor Lungenschäden nach mechanischer Beatmung.Die histologische Analyse (H&E-Färbung, 200 ×) (A) zeigt, dass ein YAP-Mangel die Lungenverletzung abschwächt, was sich in verringerten histologischen Verletzungswerten widerspiegelt.Immunfluoreszenzfärbung (B und C), RT-PCR (D) und Western-Blots (E) zeigen deutliche Abnahmen der YAP-Expression in isolierten Lungenmakrophagen.Darüber hinaus deuten ELISA-Assays darauf hin, dass die Expression von entzündungsfördernden Zytokinen, einschließlich TNF-α (F), IL-1β (G) und IL-6 (H), in YAP-defizienten Makrophagen im Vergleich zu Kontrollen signifikant herunterreguliert ist.***p < 0,001 vs. YAP+/+-Gruppe.Abbildung 2 YAP-Mangel schützt Mäuse vor Lungenschäden nach mechanischer Beatmung.Die histologische Analyse (H&E-Färbung, 200 ×) (A) zeigt, dass ein YAP-Mangel die Lungenverletzung abschwächt, was sich in verringerten histologischen Verletzungswerten widerspiegelt.Immunfluoreszenzfärbung (B und C), RT-PCR (D) und Western-Blots (E) zeigen deutliche Abnahmen der YAP-Expression in isolierten Lungenmakrophagen.Darüber hinaus deuten ELISA-Assays darauf hin, dass die Expression von entzündungsfördernden Zytokinen, einschließlich TNF-α (F), IL-1β (G) und IL-6 (H), in YAP-defizienten Makrophagen im Vergleich zu Kontrollen signifikant herunterreguliert ist.***p < 0,001 vs. YAP+/+-Gruppe.Da die M1/M2-Polarisation eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Lungenentzündung während MV spielt, haben wir zuerst die M2-Polarisation in verletzten Lungen von mechanisch beatmeten Mäusen bestimmt.CD206 wurde als M2-Makrophagenmarker angesehen, und bei YAPΔM/ΔM-Mäusen wurde eine Zunahme der Anzahl CD206-positiver M2-Makrophagen beobachtet (Abbildung 3A).Darüber hinaus bestimmten Western-Blots signifikante Erhöhungen der M2-Marker-Arg1-Proteinexpressionen in YAPΔM/ΔM-Mäusen im Vergleich zu YAP+/+-Mäusen (Fig. 3B).Als nächstes wurden Lungenmakrophagen aus YAP+/+- und YAPΔM/ΔM-Mäusen am Ende von MV isoliert.Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass der Anteil der M2-Makrophagen an den Gesamtmakrophagen bei YAPΔM/ΔM-Mäusen signifikant höher war als bei YAP+/+-Mäusen.Im Gegensatz dazu war der Anteil an M1-Makrophagen bei YAPΔM/ΔM-Mäusen im Vergleich zu YAP+/+-Mäusen deutlich verringert (Fig. 3C).RT-PCR zeigte, dass die mRNA-Expression von M2-verwandten Genen, einschließlich Arg1, Fizz, IL-10 und Ym1, bei YAPΔM/ΔM-Mäusen im Vergleich zu YAP+/+-Mäusen signifikant erhöht war (Abbildung 3D–G).Um die Funktion von YAP auf die M2-Makrophagenpolarisation weiter zu bestätigen, verwendeten wir IL-4/IL-13 zur Induktion von M2-Makrophagen in vitro.Unsere Ergebnisse legten nahe, dass die Expression von M2-Polarisationsmarkern in YAP-defizienten Makrophagen (Makrophagen aus dem Knochenmark (BMM) von YAPΔM/ΔM-Mäusen) signifikant höher war als die in Wildtyp-Makrophagen (BMM von YAP+/+-Mäusen) (Abbildung 3H–J).Abbildung 3 YAP-Mangel verstärkt M2-Makrophagenpolarisation.(A) Immunfluoreszenzfärbung zeigt, dass die Anzahl von CD206+/F4/80+ M2-Makrophagen in YAP-defizienten Mäusen erhöht ist.(B) Die Proteinexpression des M2-Makrophagenmarkers Arg1 ist auch in YAP-defizienten Mäusen hochreguliert.(C) Der Anteil von M2-Makrophagen an Gesamtmakrophagen war bei YAP-defizienten Mäusen signifikant höher als bei Wildtyp-Mäusen.(D–G) RT-PCR legt nahe, dass die Expression von M2-Makrophagen-verwandten Genen, einschließlich Arg1, Fizz1, IL-10 und Ym1, in YAP-defizienten Lungenmakrophagen hochreguliert ist.(H–J) Isolierte, aus dem Knochenmark stammende Makrophagen (BMM) wurden 24 Stunden lang mit IL-4/IL-13 behandelt.Im Vergleich zu YAP+/+ BMM zeigt YAP-defizientes BMM signifikante Zunahmen der Arg-1-, Fizz1- und IL-10-mRNA-Expression.**p < 0,01, ***p < 0,001 vs. YAP+/+ oder Vektorgruppe.Abbildung 3 YAP-Mangel verstärkt M2-Makrophagenpolarisation.(A) Immunfluoreszenzfärbung zeigt, dass die Anzahl von CD206+/F4/80+ M2-Makrophagen in YAP-defizienten Mäusen erhöht ist.(B) Die Proteinexpression des M2-Makrophagenmarkers Arg1 ist auch in YAP-defizienten Mäusen hochreguliert.(C) Der Anteil von M2-Makrophagen an Gesamtmakrophagen war bei YAP-defizienten Mäusen signifikant höher als bei Wildtyp-Mäusen.(D–G) RT-PCR legt nahe, dass die Expression von M2-Makrophagen-verwandten Genen, einschließlich Arg1, Fizz1, IL-10 und Ym1, in YAP-defizienten Lungenmakrophagen hochreguliert ist.(H–J) Isolierte, aus dem Knochenmark stammende Makrophagen (BMM) wurden 24 Stunden lang mit IL-4/IL-13 behandelt.Im Vergleich zu YAP+/+ BMM zeigt YAP-defizientes BMM signifikante Zunahmen der Arg-1-, Fizz1- und IL-10-mRNA-Expression.**p < 0,01, ***p < 0,001 vs. YAP+/+ oder Vektorgruppe.Als nächstes wollen wir die Wirkung von YAP auf die M1-Makrophagenpolarisation bestimmen.Die Immunfluoreszenzfärbung legte nahe, dass die Anzahl der pulmonalen M1-Makrophagen bei YAPΔM/ΔM-Mäusen reduziert war (Abbildung 4A).Die Expression von iNOS, einem M1-Makrophagenmarker, war bei YAPΔM/ΔM-Mäusen im Vergleich zu YAP+/+-Mäusen signifikant verringert (jeweils p < 0,001) (Abbildung 4B und C).In Übereinstimmung mit diesen Befunden waren die IL-6-, IL-1β- und TNF-α-mRNA-Expressionen in isolierten Makrophagen von YAPΔM/ΔM-Mäusen im Vergleich zu denen von YAP+/+-Mäusen deutlich verringert (jeweils p < 0,001) (Abbildung 4D– F).Zusätzlich wurden LPS und IFN-γ verwendet, um M1-Makrophagen-Polarisation in vitro zu induzieren.Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Expression von M1-Makrophagenmarkern, einschließlich iNOS, IL-6 und TNF-α, in YAP-defizienten BMM signifikant niedriger war als die von Wildtyp-BMM-Zellen (jeweils p <0,001) (Abbildung 4G–I).Abbildung 4 YAP-Mangel hemmt die M1-Makrophagenpolarisation.(A) Die Immunfluoreszenzfärbung zeigt, dass die Anzahl der iNOS+/F4/80+ M1-Makrophagen bei YAP-defizienten Mäusen verringert ist.(B) Die Proteinexpression des M1-Makrophagenmarkers iNOS ist auch in YAP-defizienten Mäusen herunterreguliert.(C–F) RT-PCR deutet darauf hin, dass die Expression von M1-Makrophagen-verwandten Genen, einschließlich iNOS, IL-6, IL-1β und TNF-α, in YAP-defizienten Lungenmakrophagen herunterreguliert ist.(G–I) Isolierte, aus dem Knochenmark stammende Makrophagen (BMM) wurden 24 Stunden lang mit LPS/IFN-γ behandelt.Im Vergleich zu YAP+/+ BMM zeigt YAP-defizientes BMM eine signifikante Abnahme der iNOS-, IL-6- und TNF-α-mRNA-Expression.***p < 0,001 vs. YAP+/+ oder Vektorgruppe.Abbildung 4 YAP-Mangel hemmt die M1-Makrophagenpolarisation.(A) Die Immunfluoreszenzfärbung zeigt, dass die Anzahl der iNOS+/F4/80+ M1-Makrophagen bei YAP-defizienten Mäusen verringert ist.(B) Die Proteinexpression des M1-Makrophagenmarkers iNOS ist auch in YAP-defizienten Mäusen herunterreguliert.(C–F) RT-PCR deutet darauf hin, dass die Expression von M1-Makrophagen-verwandten Genen, einschließlich iNOS, IL-6, IL-1β und TNF-α, in YAP-defizienten Lungenmakrophagen herunterreguliert ist.(G–I) Isolierte, aus dem Knochenmark stammende Makrophagen (BMM) wurden 24 Stunden lang mit LPS/IFN-γ behandelt.Im Vergleich zu YAP+/+ BMM zeigt YAP-defizientes BMM eine signifikante Abnahme der iNOS-, IL-6- und TNF-α-mRNA-Expression.***p < 0,001 vs. YAP+/+ oder Vektorgruppe.Um die Rollen von YAP bei der Regulation der Makrophagen-Polarisation weiter zu bestimmen, wurde die Induktion der M1- und M2-Polarisation unter Verwendung von RAW264.7-Zellen nach YAP-Plasmid-Transfektion durchgeführt.Die Effizienz der Transfektion wurde durch RT-PCR und Western-Blots bestimmt (Abbildung 5A und B).YAP-Überexpression hemmt die Induktion von M2-Makrophagen-bezogenen Genen (Arg-1, Fizz1 und IL-10) durch IL-4/IL-13-Stimulus in RAW264.7-Zellen (Abbildung 5C–E).Die YAP-Überexpression induzierte jedoch einen deutlichen Anstieg der Expression von M1-Markern (iNOS, IL-6 und TNF-α) in RAW264.7-Zellen (jeweils p < 0,001) (Abbildung 5F–H).Zusammen legten diese Ergebnisse nahe, dass YAP die M2-Makrophagenpolarisation hemmt, während die M1-Makrophagenpolarisation durch YAP-Überexpression verstärkt wurde.Abbildung 5 YAP-Überexpression hemmt M2, verstärkt jedoch die M1-Makrophagenpolarisation.In-vitro-Induktion von M1- und M2-Polarisation wurde unter Verwendung von RAW264.7-Zellen nach YAP-Plasmid- oder Vektortransfektion durchgeführt.Die Transfektionseffizienz wurde durch RT-PCR und Western-Blots (A und B) bestimmt.Die YAP-Überexpression hemmte signifikant die Expression von M2-Makrophagen-verwandten Genen (Arg-1, Fizz1, IL-10) in RAW264.7-Zellen nach IL-4/IL-13-Behandlung (C–E).Die YAP-Überexpression verbessert deutlich die Expression von M1-Makrophagen-verwandten Genen (iNOS, IL-6, TNF-α) in RAW264.7-Zellen nach IL-4/IL-13-Behandlung (F–H).***p < 0,001 vs. YAP+/+ oder Vektorgruppe.Abbildung 5 YAP-Überexpression hemmt M2, verstärkt jedoch die M1-Makrophagenpolarisation.In-vitro-Induktion von M1- und M2-Polarisation wurde unter Verwendung von RAW264.7-Zellen nach YAP-Plasmid- oder Vektortransfektion durchgeführt.Die Transfektionseffizienz wurde durch RT-PCR und Western-Blots (A und B) bestimmt.Die YAP-Überexpression hemmte signifikant die Expression von M2-Makrophagen-verwandten Genen (Arg-1, Fizz1, IL-10) in RAW264.7-Zellen nach IL-4/IL-13-Behandlung (C–E).Die YAP-Überexpression verbessert deutlich die Expression von M1-Makrophagen-verwandten Genen (iNOS, IL-6, TNF-α) in RAW264.7-Zellen nach IL-4/IL-13-Behandlung (F–H).***p < 0,001 vs. YAP+/+ oder Vektorgruppe.Die Hauptergebnisse dieser Studie können wie folgt zusammengefasst werden: (1) mechanische Beatmung für 12 Stunden induziert eine ausgeprägte Lungenentzündung zusammen mit einer hochregulierten YAP-Expression;(2) YAP-Mangel fördert M2-Makrophagenpolarisation, während M1-Polarisation in vivo und in vitro gehemmt wird.(3) YAP-Überexpression hemmt die M2-Polarisation, verbessert aber die M1-Polarisation;(4) YAP-Mangel in Makrophagen schützt Mäuse vor MV-induzierter Lungenschädigung durch Herunterregulierung der Entzündung durch Regulierung der M1/M2-Polarisation.Obwohl gut gezeigt wurde, dass YAP in Tumorzellen als transkriptioneller Koaktivator wirkt,20 ist seine Funktion in Makrophagen begrenzt.Tatsächlich ist das Expressionsniveau von YAP in Immunzellen, einschließlich Monozyten und Makrophagen, bei Säugetieren relativ niedrig.11 Immer mehr Beweise deuten jedoch darauf hin, dass YAP eine wichtige Rolle bei der Regulierung der M1/M2-Makrophagenpolarisation spielt,11,21,22 die dies getan hat wurde vorgeschlagen, Lungenentzündungen während ALI und ARDS zu regulieren.4,5 Als Transkriptionskoaktivator transloziert dephosphoryliertes YAP in den Zellkern, wo es mit Transkriptionsfaktoren (TFs) oder TFs, die ein PPXY-Motiv besitzen, interagiert23.Anschließend beteiligt sich YAP am pathophysiologischen Prozess durch die Induktion der Transkription von Zielgenen.24 Diese Beweise zeigten, dass YAP in den meisten Fällen auf Proteinebene wirkt.In der vorliegenden Studie berichten wir zum ersten Mal, dass MV eine übermäßige Expression von YAP sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene in Lungenmakrophagen induziert.Wichtig ist, dass unsere Studie zeigt, dass YAP eine doppelte Rolle bei der Regulierung der Makrophagenpolarisation in der Lunge während MV spielt.In-vitro-Experimente zeigten, dass YAP Makrophagen in Richtung M1-Polarisation treibt, während es die M2-Polarisation einschränkt.Darüber hinaus regulierte YAP-Mangel die M1-Polarisation nach unten, verbesserte jedoch die M2-Polarisation im Lungengewebe nach 12 Stunden mechanischer Beatmung.Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die Induktion von YAP in Lungenmakrophagen wahrscheinlich zum Ungleichgewicht zwischen M1/M2-Polarisation und nachfolgender Entzündung nach mechanischer Beatmung beiträgt.Da eine Lungenschädigung nach mechanischer Beatmung häufig mit einer Entzündungsreaktion einhergeht,25 könnte YAP ein potenzielles therapeutisches Ziel einer durch mechanische Beatmung induzierten Lungenschädigung sein.Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Induktion von YAP zu einem Ungleichgewicht zwischen der M1/M2-Makrophagenpolarisation und einer übermäßigen Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen, einschließlich Il-6, IL-1β und TNF-α, führt.Der zugrunde liegende Mechanismus, durch den YAP die M1/M2-Makrophagenpolarisation reguliert, wurde jedoch in der vorliegenden Studie nicht dokumentiert.Es wurde gezeigt, dass die Proteine ​​Signaltransducer und Transkriptionsaktivator (STAT), Interferon-regulatorische Faktoren (IRF) und CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP) entscheidende Faktoren bei der M1/M2-Makrophagenpolarisation sind.26–28 Allerdings , ob die regulatorischen Wirkungen von YAP auf die M1/M2-Makrophagenpolarisation mit diesen Faktoren assoziiert sind, ist unklar.Frühere Studien haben berichtet, dass YAP an den Promotor von IL-6 binden und die IL-6-Produktion im Darmgewebe steigern kann.11 Darüber hinaus ist YAP durch die Förderung der IL-6-Expression an der Immunreprogrammierung beim duktalen Adenokarzinom des Pankreas beteiligt.29 In der In dieser Studie haben wir beobachtet, dass YAP die IL-6-Expression in RAW264.7-Zellen fördern kann und ein YAP-Mangel die IL-6-Expression im Lungengewebe nach mechanischer Beatmung reduziert.Angesichts der sich schnell häufenden Beweise, die die zielgerichtete IL-6-Therapie bei entzündlichen Autoimmunerkrankungen unterstützen,30 legen unsere Ergebnisse nahe, dass das Targeting von YAP in Makrophagen eine mögliche Therapie für durch mechanische Beatmung induzierte Lungenentzündung und nachfolgende Verletzungen sein sollte.Andererseits hemmt die Induktion von YAP die Expression des M2-Makrophagenmarkers Arg1, was mit früheren Befunden in Hepatozyten übereinstimmt.31 Darüber hinaus hemmt YAP die Produktion von entzündungshemmenden Zytokinen in vivo und in vitro.Wichtig ist, dass Arg1 als Schlüsselenzym des Stoffwechsels mit einer Vielzahl von Entzündungskrankheiten in Verbindung gebracht wird.32 Auch hier deuten unsere Ergebnisse auf eine wichtige Rolle von YAP im Entzündungsprozess hin.Zusammenfassend trägt die frühe Induktion von YAP in Makrophagen wahrscheinlich zur Lungenentzündung nach mechanischer Beatmung bei.Daher könnte YAP als potenzielles therapeutisches Ziel für VILI in Betracht gezogen werden.Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um den zugrunde liegenden Mechanismus aufzuklären, durch den YAP die M1/M2-Makrophagenpolarisation reguliert.Es sind keine Fördermittel zu melden.Alle Rechte vorbehalten.Registriert in England und Wales.